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免疫组化、免疫印迹对比分享

更新时间:2024-07-04      浏览次数:197

一、原理差异

免疫组化:融合了免疫学原理(抗原抗体特异性结合)和组织学技术(组织的取材、固定、包埋、切片、脱蜡、水化等),通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素)显色,来对组织(细胞)内抗原(多肽和蛋白质)进行定位、定性及相对定量的研究(主要是定位)。样本是细胞或组织,称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。要在显微镜下观察结果,可能出现膜阳性、质阳性和核阳性。

免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting),是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。先要进行SDS-PAGE,然后将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载体上,而后利用抗原-抗体-标记物显色来检测样品,可以用于定性和半定量。结合化学发光检测,可以同时比较多个样品同种蛋白的表达量差异。

二、实验目的

免疫组化 IHC / IF / ICC ——蛋白定位检测分析

1.定位较直接准确

2.定性灵敏度高

3.半定量(高质量染色,背景浅,特异性强的切片;表达量较多的蛋白)


免疫印迹试验 Western blot

1.测样品内蛋白含量,定量较IHC更准确

2.定性和间接定位,敏感性远远低于免疫组化技术

三、实验准备

(一)免疫组化实验样本
(新鲜,固定方式,充分脱水,防脱处理)

1.取材新鲜,及时固定:防止离体太久而发生组织自溶长菌,抗原扩散或丢失,易保存

2.固定液:

(1)醛类:形态结构保存好,穿透性强,组织收缩少;醛基与蛋白氨基交联形成羧甲基,使抗原决定簇不能充分暴露,需要抗原修复

- 4%多聚甲醛(常用,适用大多数组织,细胞)

- 10%福尔马林/甲醛(常用,脂肪类,脊髓类)

-戊 二 quan(微细结构保存好,用于电镜)

(2)醇类:穿透性强,脱水性强,易引起组织收缩,使蛋白变性作用轻,抗原可流失。

-乙醇,甲醇

(3)其他固定剂

-丙酮,抗原保存性好,脱色性更强,常用于部分细胞爬片

-混合固定剂,Bouni 液,Zamboni液,AAF液等

固定时间:醛类建议24小时以内,醇类,丙酮2小时以内,组织大小厚度略有差异

3. 充分脱水:保存时间长,防止裂片,保持组织结构,防止冰切形成冰晶

4. 防脱处理:防止掉片,多聚赖氨酸防脱切片,明胶和硫酸铬钾处理等


免疫组化切片类型

1.石蜡切片

易保存(干燥低温4~8℃保存),厚度3~6um,结构形态好,需要抗原修复,抗原活性偏低(烤片,固定等)

2.冰冻切片

不易保存(-80℃保存半年),厚度10~20um,形态结构较差,抗原活性高,不一定抗原修复,胞内核内抗原需打孔

冰冻切片是否需要抗原修复?如何固定?

(1)不能及时切片染色观察:可选择固定(24小时内)后切片,需要修复;或马上包埋切片后固定(10 min以内),可修复可不修复

(2)马上切片染色观察的,可不固定,可不修复

3.细胞爬片(贴壁,半贴壁,悬浮)

单层细胞,均匀爬片,选择合适的固定方式保证细胞形态,细胞周期同一化,不需要修复---培养皿/平板 ---盖玻片爬片

(二)实验准备-WB实验样本

1.新鲜制备,低温 裂解 (全蛋白,不包括核抽提、亚细胞器分离等)

2.裂解液,蛋白酶抑制剂,磷酸酶抑制剂

3.研磨(组织),液氮(小体积组织),超声波(细菌/细胞)

4.跑胶,蛋白定量


注意事项:

1.防止蛋白降解,磷酸化蛋白防止去磷酸化

2.浓度低蛋白量少不易检测,浓度高裂解液粘稠不易吸取

3.分泌型蛋白,无血清细胞培养收集上清,TCA沉淀富集

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