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乙酰辅酶 A(Acetyl-CoA)含量测定试剂盒说明书

更新时间:2024-06-06      浏览次数:132

乙酰辅酶 AAcetyl-CoA)含量测定试剂盒说明书

分光光度法 25 /24

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义

乙酰辅酶 A 广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。是生物体能源物质代谢过程中产生的一种重要的中间代谢产物。在体内能源物质代谢中是一个枢纽性的物质。糖、脂肪、蛋白质三大营养物质通过乙酰辅酶 A 汇聚成一条共同的代谢通路-三羧酸循环和氧化磷酸化,经过这条通路氧化生成二氧化碳和水,释放能量用于 ATP 合成。此外,乙酰辅酶A 是合成脂肪酸,酮体,胆固醇及其衍生物等生理活性物质的前体物质。

测定原理

苹果酸脱氢酶可催化苹果酸和NAD 生成草酰乙酸和NADH。柠檬酸合酶可催化乙酰辅酶 A 和草酰乙酸生成柠檬酸和辅酶 A。利用苹果酸脱氢酶和柠檬酸合酶的偶联反应,乙酰辅酶 A 含量和 NADH 的生成速率成正比,340nm 下吸光值的上升速率反应了乙酰辅酶 A 含量的高低。

需自备的仪器和用品

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

试剂一:液体 25mL×1 瓶,4℃保存。

试剂二:粉剂×1 支,-20℃保存。临用前加入 250μL 试剂五充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂三:液体 10μL×1 支,4℃保存。临用前加入 250μL 试剂五充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂四:粉剂×1 瓶,-20℃保存。临用前加入 22.5mL 试剂五充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂五:液体 30mL×1 瓶,4℃保存。

工作液的配制:临用前请根据拟用工作液体积样本数×0.92  m  L,将试剂二、三和四按照 1:1:90 的比例混合,或者直接把试剂二和试剂三加入到试剂四中混匀(可以测定 24 加样前置 37℃(哺乳动物) 25℃(其它物种)水浴锅中预热 30 min;现配现用;

乙酰辅酶 A 的提取

1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量

104 :试剂一体积mL 500~10001 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 试剂一,超声波破碎细菌或细胞冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、组织:按照组织质量g:试剂一体积(mL) 15~10 的比例建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一,进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤

1 分光光度计预热 30min,用蒸馏水于 340nm 处调零。

2、取 920μL 工作液和 100μL 样本至 1mL 石英比色皿,混匀,立即记录 340nm 20s 的吸光值 A1 80s 时的吸光值 A2,计算 ΔA=A2-A1


乙酰辅酶 A 含量计算

标准条件下测定的回归方程为 y = 1640x + 0.012x 为吸光值,y 为标准品浓度nmol/mL

注意:本试剂盒低检测限为 1.6nmol/mL

(1) 按照蛋白浓度计算

乙酰辅酶A 含量(nmol/mg prot)=[(1640×ΔA0.012) ×V1]÷(V1×Cpr)=(1640×ΔA0.012) ÷Cpr

需要另外测定,建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。

(2) 按照样本质量计算

乙酰辅酶 A 含量(nmol/g 鲜重)=[(1640×ΔA0.012) ×V1]÷(W×V1÷V2)=(1640×ΔA0.012)

÷W

(3 )  按照细菌或细胞密度计算:

乙酰辅酶 A 含量(nmol/104)=[(1640×ΔA0.012)×V1]÷(500×V1÷V2)=(1640×ΔA0.012)÷500

V1:加入反应体系中样本体积,0.1mLV2:加入提取液体积,1 mLCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g500:细胞或细菌总数,500 万。


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