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ELISA检测方法原理、操作步骤及常见问题

更新时间:2025-03-17      浏览次数:347

ELISA(酶联免疫吸附测定)是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的实验技术。由于其高灵敏度和具体性,ELISA已成为检测抗体、激素、蛋白质和病原体的方法。


一、ELISA检测原理

基本原理


ELISA依赖于特定的抗原与抗体之间的亲和作用。实验中,抗体或抗原先被固定在微孔板上,然后添加待测样本,使其与固定的生物分子发生反应。通过链接有酶的二抗,使目标物质产生信号,信号的强度与目标物质的量成正比,通过光度计测量这些信号来定量分析样品中的成分。


方法类型

  • 直接ELISA:使用直接标记有酶的抗体对抗原进行检测。
  • 间接ELISA:使用两种抗体,第一抗体特异地识别抗原,第二抗体识别第一抗体并标记有酶。
  • 夹心ELISA:利用两种抗体夹住抗原,其中一种固定,另一种标记有酶。
  • 竞争ELISA:抗原和标记有酶的抗原竞争同一抗体的结合位。

二、实验前的准备

实验材料


执行ELISA实验需要以下关键材料和试剂:


  • 抗体:选择高特异性和亲和力的抗体。
  • 酶标记底物:常用的酶如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP),底物选择应与酶相匹配。
  • 洗涤液:通常使用含有Tween-20的PBS缓冲液以减少非特异性结合。
  • 阻断液:用于阻断微孔板中未被抗体或抗原占据的位点,防止非特异性吸附。

设备与环境

  • 酶标仪:用于读取酶反应产生的光信号。
  • 实验室环境:需要保持清洁,温度和湿度控制适中以保证实验的准确性和重复性。

三、操作步骤详解

1. 样品准备

  • 处理:取所需样品体积,如有必要,进行适当稀释以符合测试范围。

  • 存储:将样品分装在避光小管中,存放于-20°C以下以避免降解。避免反复冻融,建议分装成单次使用量。

2. 加样与孵育

  • 加样:在微孔板中加入50 µL样品到每个测试孔中。使用多通道移液器可以提高效率和准确性。

  • 孵育:将孔板覆盖,放置在37°C孵育器中孵育1小时,或根据抗体配套文件推荐的时间进行孵育。

3. 洗涤

  • 洗涤次数:用自动洗板机或手动洗板,每次加入300 µL洗涤缓冲液,静置几秒后弃液,重复此过程至少3次。

  • 洗涤技巧:确保每次洗涤液充分覆盖孔底,避免泡沫产生,因泡沫可能导致孔间污染。

4. 酶标底物加入和信号发展

  • 底物加入:向每个孔中加入100 µL酶底物(如TMB),在避光条件下室温孵育15-30分钟。

  • 终止反应:加入50 µL的终止液(如2N硫酸),反应立即停止,并将颜色由蓝变黄。

5. 读取结果

  • 使用酶标仪:在450 nm波长下读取吸光度值。如果可能,读取650 nm作为参考波长,以校正板材不均或泡沫的影响。


四、注意事项与经验分享

常见问题及对策

  • 孔板交叉污染:使用新的吸头和适当的技术,如慢速释放液体到孔壁,避免液体直接冲击到孔底。

  • 底物不稳定:底物开封后应避光保存,并在推荐的有效期内使用,过期底物可能导致信号弱或背景高。

经验技巧

  • 提高灵敏度:优化底物的孵育时间,观察颜色变化,避免过度孵育导致信号饱和。

  • 减少非特异性背景:增加阻断步骤的时间或使用高效的阻断剂,如脱脂牛奶粉或BSA,以填补未被抗体或抗原占据的微孔板表面。


随着生物技术的快速发展,我们可以预见到ELISA技术将变得更加自动化和敏感,未来可能引入更多的数字化和微流控技术,以进一步提高其准确性和效率。这些改进将为临床诊断和生物医学研究提供更强大的支持。
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