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处理:取所需样品体积,如有必要,进行适当稀释以符合测试范围。
存储:将样品分装在避光小管中,存放于-20°C以下以避免降解。避免反复冻融,建议分装成单次使用量。
加样:在微孔板中加入50 µL样品到每个测试孔中。使用多通道移液器可以提高效率和准确性。
孵育:将孔板覆盖,放置在37°C孵育器中孵育1小时,或根据抗体配套文件推荐的时间进行孵育。
洗涤次数:用自动洗板机或手动洗板,每次加入300 µL洗涤缓冲液,静置几秒后弃液,重复此过程至少3次。
洗涤技巧:确保每次洗涤液充分覆盖孔底,避免泡沫产生,因泡沫可能导致孔间污染。
底物加入:向每个孔中加入100 µL酶底物(如TMB),在避光条件下室温孵育15-30分钟。
终止反应:加入50 µL的终止液(如2N硫酸),反应立即停止,并将颜色由蓝变黄。
使用酶标仪:在450 nm波长下读取吸光度值。如果可能,读取650 nm作为参考波长,以校正板材不均或泡沫的影响。
四、注意事项与经验分享
孔板交叉污染:使用新的吸头和适当的技术,如慢速释放液体到孔壁,避免液体直接冲击到孔底。
底物不稳定:底物开封后应避光保存,并在推荐的有效期内使用,过期底物可能导致信号弱或背景高。
提高灵敏度:优化底物的孵育时间,观察颜色变化,避免过度孵育导致信号饱和。
减少非特异性背景:增加阻断步骤的时间或使用高效的阻断剂,如脱脂牛奶粉或BSA,以填补未被抗体或抗原占据的微孔板表面。
025-65010873
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